1、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量為高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對(duì)應(yīng)的模版序列的Tm值最好在72°C左右

Tm值在72°C左右可使復(fù)性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值在72°C左右可使復(fù)性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T），在Oligo軟件中使用的是最鄰近法（the nearest neighboor method）;

4、引物3'端的堿基一般不用A

引物3'端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。

5、引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

6、引物3'端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

7、如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率；

8、引物5'端可以修飾

引物5'端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。

9、堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross Dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal/mol)。否則易導(dǎo)致引物二聚體帶的產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

10、引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3'端AG值較低，而5'端和中間ΔG值相對(duì)較高。AG值(自由能)反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，一般情況下，引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3端AG值較低，而5端和中間AG值相對(duì)較高。3'端的AG值相對(duì)要低，且絕對(duì)值不要超過9引物的3'端的AG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

11、引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

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