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    CRISPR-Cas9系統(tǒng):慢病毒轉(zhuǎn)染

    發(fā)布時間: 2024-04-29  點(diǎn)擊次數(shù): 474次

    CRISPR慢病毒轉(zhuǎn)染法是一種高效引入CRISPR基因編輯系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞中的技術(shù),旨在實現(xiàn)對基因的有針對性編輯或調(diào)控。


    實驗步驟:

    1.質(zhì)粒構(gòu)建:構(gòu)建好含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。該質(zhì)粒攜帶

    sgRNA序列,可指導(dǎo)Cas9蛋白準(zhǔn)確識別并切割目標(biāo)。


    2.慢病毒包裝質(zhì)粒:準(zhǔn)備慢病毒包裝質(zhì)粒,其中包括pCMV-VSV-G(攜帶包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(攜帶包裝蛋白)。這兩者協(xié)同作用,使得慢病毒能夠高效地傳遞CRISPR-Cas9系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。


    3.細(xì)胞培養(yǎng):使用適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞,通常選擇293T細(xì)胞,以確保細(xì)胞處于最佳的生長狀態(tài)。


    4.轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備:在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前,將培養(yǎng)基更換為適用于陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基。同時,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑,包括Lipofectamine 3000、助轉(zhuǎn)劑P3000以及含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒。

    CRISPR-Cas9系統(tǒng):慢病毒轉(zhuǎn)染

    5.轉(zhuǎn)染操作:將質(zhì)?;旌衔锱c轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒的推薦比例進(jìn)行混合,隨后滴加到目標(biāo)細(xì)胞上,此過程中,確保混合物與細(xì)胞充分接觸,有利于轉(zhuǎn)染效率的提高。


    6.培養(yǎng)條件:將細(xì)胞置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)一定的時間,通常在48小時內(nèi)。


    7.收獲:收集細(xì)胞上清液,通過離心去除細(xì)胞殘渣。


    8.濾膜過濾:使用0.22 μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾細(xì)胞上清液,以去除殘留的細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。


    9.慢病毒收獲:得到的慢病毒上清液即為經(jīng)過純化和感染活性驗證的慢病毒,可用于后續(xù)實驗中對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行感染(若病毒感染效率低,可使用試劑盒進(jìn)行濃縮病毒)。


    10.慢病毒感染:將目的細(xì)胞接種于 6孔板中,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行慢病毒感染,感染后48H,加入適量濃度的篩選藥物puromycin(具體濃度通過藥物篩選實驗獲得),24h后換液去除死細(xì)胞,繼續(xù)傳代維持培養(yǎng)。


    11.單克隆篩選:

    ①流式細(xì)胞術(shù)篩選:此法存在一些不足之處,其中包括重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式篩選的過程。因為這種操作可能導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)歷多次振蕩,增加了細(xì)胞的脆弱性,細(xì)胞的生存狀況可能會受到不良影響,所以不太建議采用這種方式。


    ②無限稀釋法,將96個細(xì)胞稀釋至10ml培養(yǎng)基中,然后將其種植到96孔板中,確保每個孔內(nèi)只有一個細(xì)胞。完成種植后,建議在觀察過程中每次僅觀察十個孔,因為長時間的外部觀察可能導(dǎo)致細(xì)胞受到應(yīng)激損傷,影響后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng),甚至?xí)?dǎo)致部分細(xì)胞死亡。進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)時,首先將細(xì)胞鋪在96孔板中,培養(yǎng)至細(xì)胞長至80%的融合后進(jìn)行消化。隨后,將細(xì)胞傳到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中,以確保單克隆的純化。并非所有細(xì)胞都能成功生長,因此在考慮實際情況時,一般需要大約一兩個月的時間才能獲得理想的實驗結(jié)果。


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