01

1. 將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃

2. 細(xì)胞實驗室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。

3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

02

1. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對應(yīng)編號。

2. 從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。

03

1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2. 約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

04

用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min?離心3分鐘。

05

1. 吸棄上清液。

2. 向離心管內(nèi)加入10ml*培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

3. 用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

06

細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

07

將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細(xì)胞情況而定。

08

1. 注意無菌操作。
2. 取細(xì)胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。
3. ☆此項尤為重要，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套。
4. 應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
5. 細(xì)胞復(fù)蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃水箱中取出的細(xì)胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋中進(jìn)行解凍。
6. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少其對細(xì)胞的損傷。
7. 細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml－15ml培養(yǎng)液，經(jīng)驗總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
8. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。
9. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會比較大，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響。還有一個說法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。  

結(jié)果分析

判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。

如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長，達(dá)到正常的生長特性（比如細(xì)胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細(xì)胞儲存數(shù)量。